【RNA結(jié)合蛋白ARID5A驅(qū)動IL-17依賴性自身抗體誘導(dǎo)的腎小球腎炎】
自身抗體介導(dǎo)的腎小球腎炎（AGN）是由腎臟炎癥失調(diào)引起的重大健康問題，盡管現(xiàn)有的治療方法可以提高生存率，但效果有限，而且副作用嚴(yán)重。因此，迫切需要改進的治療方法。IL-17在AGN中的作用已被廣泛研究，但其下游的分子信號以及調(diào)控機制仍不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白ARID5A(AT-rich interactive domain-containing protein 5a)在AGN中顯著上調(diào)，并在IL-17依賴性腎臟炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
文章題目：The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis
發(fā)表期刊：Journal Of Experimental Medicine
科研團隊：美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)系、免疫學(xué)系等
發(fā)表時間：2024年7月26日
主要發(fā)現(xiàn)
1. ARID5A在AGN中起關(guān)鍵作用：ARID5A通過調(diào)控IL-17依賴性炎癥反應(yīng)，驅(qū)動AGN的病理過程。
2. ARID5A的翻譯調(diào)控功能：ARID5A通過與核糖體相互作用，增強關(guān)鍵炎癥轉(zhuǎn)錄因子（如C/EBPs）的翻譯，從而促進AGN的發(fā)展。
研究意義
該研究揭示了ARID5A在IL-17依賴性腎臟炎癥中的重要作用，為開發(fā)針對AGN的新型治療策略提供了潛在靶點。通過選擇性抑制ARID5A，可能在不影響宿主防御的情況下，有效控制自身免疫性腎臟疾病。
研究結(jié)果
1.ARID5A在人類和小鼠AGN中表達升高
ARID5A在人組織中的表達：分析歐洲腎臟cDNA數(shù)據(jù)庫（European Renal cDNA Bank）發(fā)現(xiàn)IL17RA mRNA在多種AGN中表達升高。類似地ARID5A mRNA也在多種AGN（如IgA腎病、ANCA相關(guān)性腎炎等）中顯著上調(diào)。采用RNAScope原位雜交對腎組織進行活檢，結(jié)果表明在ANCA-GN患者中ARID5A的表達也顯著升高。
ARID5A在小鼠中的表達：在Act1缺失小鼠（Act1?/?）的腎組織中ARID5A的誘導(dǎo)減弱，以及IL-17特征減少，因此ARID5A的誘導(dǎo)依賴于IL-17信號通路。與ANCA-GN患者類似，在AGN期間的腎小管上皮細胞（RTECs）中ARID5A的表達顯著上調(diào)。因此，ARID5A主要在AGN期間的IL-17應(yīng)答性腎臟細胞中高表達。
圖1. AGN期間ARID5A在人和小鼠腎上皮中表達升高。
2.ARID5A能夠增強AGN病理
腎功能保護：ARID5A缺失的小鼠誘導(dǎo)AGN后，腎功能指標(biāo)（如血尿素氮BUN和肌酐）顯著低于野生型小鼠，表明ARID5A缺失能夠保護腎臟免受AGN的損害。
炎癥反應(yīng)減弱：ARID5A缺失小鼠的腎臟中，IL-17依賴性炎癥因子（如IL-6、Lcn2、Ccl2等）的表達顯著降低，且髓系細胞（如單核細胞和巨噬細胞）的浸潤也明顯減少。
組織病理學(xué)改善：ARID5A缺失小鼠的腎臟組織病理學(xué)評分顯著改善，異常腎小球的數(shù)量減少，表明ARID5A在AGN的病理過程中起關(guān)鍵作用。
圖2. ARID5A對于AGN是必需的。
3.ARID5A調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白積累
C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的表達：在AGN模型中，C/EBPβ和C/EBPδ的mRNA水平在ARID5A缺失小鼠中并未顯著變化，但其蛋白水平顯著降低。這表明ARID5A主要通過調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯而非轉(zhuǎn)錄來影響其表達。
IL-17誘導(dǎo)的C/EBP蛋白積累：在體外實驗中，IL-17刺激后，ARID5A缺失的RTECs中C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平顯著降低，進一步證實了ARID5A在IL-17依賴性C/EBP蛋白積累中的關(guān)鍵作用。
圖3. ARID5A調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子。
4.ARID5A結(jié)合的RNA靶點鑒定
RIP-Seq分析：通過RNA免疫沉淀測序（RIP-Seq），研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A在IL-17刺激后與多種RNA結(jié)合，其中包括炎癥相關(guān)mRNA（如CEBPD、NFKBIZ）以及核糖體RNA（rRNA）和翻譯相關(guān)RNA。
圖4. 鑒定RTECs中ARID5A靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。
5.ARID5A與核糖體相互作用，促進蛋白質(zhì)翻譯
ARID5A與核糖體的相互作用：嘌呤霉素?fù)饺雽嶒灡砻鰽RID5A以某種方式促進翻譯。通過蔗糖梯度離心（Polysome profiling）和免疫印跡分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A主要與40S核糖體亞基結(jié)合，而在60S和80S核糖體中的結(jié)合較弱，表明ARID5A可能在翻譯起始階段發(fā)揮作用。熒光共聚焦成像顯示IL-17依賴的ARID5A與核糖體共定位。此外，IL-17促進ARID5A從細胞核輸出到細胞質(zhì)，并與40S核糖體亞基（18S rRNA）結(jié)合。ARID5A還與60S核糖體亞基（5S rRNA）有較弱的相互作用，表明ARID5A可能在翻譯起始過程中發(fā)揮動態(tài)作用。
全局翻譯調(diào)控：ARID5A缺失的細胞中，全局蛋白質(zhì)合成顯著減少，表明ARID5A在維持細胞翻譯活性中起重要作用。
炎癥因子的翻譯增強：IL-17刺激后，ARID5A通過與核糖體結(jié)合，增強了C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率，從而促進了AGN的病理過程。
圖5. Arid5a促進RTECs中的蛋白質(zhì)合成。
ARID5A功能在ST2細胞中的驗證：在IL-17敏感的ST2細胞中，ARID5A同樣表現(xiàn)出與核糖體的相互作用，并調(diào)控炎癥因子的翻譯。RIP-Seq分析顯示，ARID5A在ST2細胞中結(jié)合的RNA靶點與HK-2細胞中的結(jié)果高度一致，進一步驗證了ARID5A在IL-17信號通路中的保守功能。
圖6. Arid5a結(jié)合rRNA，促進小鼠基質(zhì)細胞中的蛋白質(zhì)合成。
ARID5A在AGN中的病理機制模型：IL-17刺激后，ARID5A從細胞核輸出到細胞質(zhì)，與40S核糖體亞基結(jié)合，增強C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率。這些炎癥因子進一步促進腎臟炎癥和AGN的病理過程。
圖7. Arid5a的作用模型。
研究小結(jié)
這項研究揭示了ARID5A在IL-17依賴性腎臟炎癥中的關(guān)鍵作用，特別是通過調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯來驅(qū)動AGN的病理過程。ARID5A的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)針對AGN的新型治療策略提供了潛在靶點，尤其是通過選擇性抑制ARID5A來阻斷IL-17信號通路，可能在不影響宿主防御的情況下有效控制自身免疫性腎臟疾病。
參考文獻
Yang Li, Shachi P Vyas, Isha Mehta, et al. (2024). The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis. Journal of Experimental Medicine, 221(9), e20240656. doi:10.1084/jem.20240656
RBP研究方案設(shè)計：RIP-seq + Polysome profiling
1. 研究背景
RNA結(jié)合蛋白（RBP）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用，影響RNA的穩(wěn)定性、定位、翻譯和降解。RIP-seq（RNA免疫共沉淀測序）和Polysome Profiling（多核糖體分析）聯(lián)合使用，可全面研究RBP與RNA的相互作用及其對翻譯的影響。
2. 研究目標(biāo)
1) 鑒定特定RBP結(jié)合的RNA分子。
2) 分析RBP對RNA翻譯效率的影響。
3) 探索RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的機制。
3. 實驗設(shè)計
3.1 實驗材料
1) 細胞系：選擇目標(biāo)RBP高表達的細胞。
2) 抗體：針對目標(biāo)RBP的特異性抗體。
3.2 實驗步驟
3.2.1 細胞培養(yǎng)與處理
1) 培養(yǎng)目標(biāo)細胞至對數(shù)生長期。
2) 根據(jù)實驗需求處理細胞（如藥物處理、基因敲除/過表達等）。
3.2.2 RNA免疫共沉淀（RIP）
1) 細胞裂解：收集細胞，使用裂解緩沖液裂解。
2) 免疫沉淀：加入RBP特異性抗體，孵育后與蛋白A/G磁珠結(jié)合，捕獲RBP-RNA復(fù)合物。
3) 洗滌：洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合。
4) RNA提取：解離RBP-RNA復(fù)合物，提取RNA。
3.2.3 Polysome Profiling
1) 細胞裂解：收集細胞，使用裂解緩沖液裂解。
2) 蔗糖梯度離心：制備蔗糖梯度，超速離心分離多核糖體。
3) 分部收集：收集不同密度的多核糖體組分。
4) RNA提取：從各組分中提取RNA。
3.2.4 RNA-seq
1) RNA質(zhì)量檢測：檢測RNA質(zhì)量。
2) 建庫：使用RNA-seq建庫試劑盒構(gòu)建測序文庫。
3) 測序：進行高通量測序（如Illumina平臺）。
3.2.5 數(shù)據(jù)分析
1) 數(shù)據(jù)預(yù)處理：去除低質(zhì)量reads和接頭序列。
2) 比對：將reads比對到參考基因組。
3) 差異表達分析：比較RIP-seq和Polysome Profiling數(shù)據(jù)，識別RBP結(jié)合的RNA及其翻譯效率變化。
4) 功能注釋：對差異表達的RNA進行GO和KEGG通路分析。
4. 預(yù)期結(jié)果
1) 鑒定出RBP結(jié)合的靶RNA。
2) 分析RBP對RNA翻譯效率的影響。
3) 揭示RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的潛在機制。
5. 研究意義
1) 全面解析RBP的功能及其對RNA翻譯的調(diào)控機制。
2) 提供RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的新見解。
3) 為相關(guān)疾病機制研究和治療靶點開發(fā)提供依據(jù)。
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